تعیین نوع ستون HPLC

folder_openآزمایشگاه
commentبدون دیدگاه

ابتدا باید مشخص کنید که قصد دارید HPLC فاز نرمال یا فاز معکوس انجام دهید.

در HPLC فاز نرمال، فاز ساکن آبدوست و فاز متحرک آب‌گریز است. اما روش HPLC فاز معکوس متداول‌تر است. در HPLC فاز معکوس، فاز متحرک آبدوست و فاز ساکن آبگریز است. این بدان معناست که مولکول‌ها بر اثر کاهش قطبیت از طریق استفاده از یک حلال آلی، شسته می‌شوند.

حال که متوجه تفاوت فاز نرمات و معکوس شدیم، باید بررسی کنیم که چه ویژگی‌هایی در ستون اهمیت دارند؟

مواد پرکننده ستون

سیلیکاژل متداول‌ترین ماده پرکننده‌ی ستون است.

سطح این ماده دارای گروه‌های سیلانول است. گروه‌های سیلانول بسیار قطبی هستند و می‌توانند با مولکول‌های غیرقطبی موجود در فاز مایع شما برهم‌کنش کنند. همچنین این گروه‌ها می‌توانند به عنوان سایت‌های پیوند شیمیایی عمل کنند. اندازه‌ی بزرگ سطح سیلیکاژل، ظرفیت جذب بالایی را نیز فراهم می‌کند.

ذرات سیلیس صلب هستند که به آن‌ها کمک می‌کند در برابر فشردگی مقاوم باشند. این ویژگی هنگام استفاده از فشارهای بسیار زیاد برای مولکول‌های بسیار کوچک حائز اهمیت است. اسیدیته کم سیلیس، مانع از برهم‌کنش بین بازها و فاز مایع شما و در نتیجه بهبود شکل پیک حاصل می‌شود.

اگر در مقیاس کوچک کار می‌کنید و به ستونی نیاز دارید که بتواند در pHهای شدید کار کند، پرکننده‌های پلیمری گزینه‌های مناسبی هستند. این پرکننده‌ها پایدار بوده و سبب شویش فاز مایع نمی‌شوند. علاوه بر این، پلیمرها به دلیل داشتن پوشش‌های مختلف، عملکردهای بیشتری برای ستون دارند.

اندازه منافذ و ذرات

اندازه منافذ مورد نظر شما بر اساس وزن مولکولی ترکیب شما است.

مولکول‌های کوچک باید کمتر از 120 آنگستروم باشند. پلی پپتیدها و ترکیبات حاوی چند پروتئین باید حدود 200-400 آنگستروم باشند. پروتئین‌های دارای وزن مولکولی بسیار بالا، باید حدود 1000-4000 آنگستروم باشند. در گذشته همیشه اندازه ذرات به صورت استاندارد، 5 میکرون بود. اما در اواسط دهه 90، این استاندارد به 3.5 میکرون کاهش یافت.

اگر بخواهید تفکیک سریع‌تر یا بهتری داشته باشید، می‌توانید از ذرات کوچکتر (حتی کمتر از 2 میکرون) استفاده کنید. اما توجه داشته باشید که برای این مقدار ذرات، باید طول ستون‌های شما کوتاهتر باشد. بسیاری از این موارد مربوط به افزایش فشار برگشتی است که با کاهش طول ستون و کاهش اندازه‌ی ذرات افزایش می‌یابد.

استفاده از ستون‌های بزرگتر برای دستگاه‌هایی که در فشار بیشتر کار می‌کنند، کاربرد دارد.

ابعاد ستون

اندازه‌ی ستون قبلا به همراه اندازه‌ی ذرات استاندارد شده است (4.6 میلی‌متر در 100 میلی‌متر). در صورت نیاز به تفکیک بیشتر، از ستون‌های 150 میلی‌متری یا 250 میلی‌متری استفاده می‌شود.

استفاده از ستون با اندازه‌ی کوچکتر ارجح است، زیرا ارزان‌تر است و مقدار کمتری از نمونه‌ی شما را مصرف می‌کند. اگر مقدار نمونه‌تان کم است، می‌توانید از نانوستون‌ها (کمتر از 1 پیکوگرم)، ستون‌های موئینه (پیکوگرم تا نانوگرم) یا ستون‌های میکرو (نانوگرم تا میکروگرم) استفاده کنید.

همچنین کاهش قطر می‌تواند حساسیت بسیار بیشتری ایجاد نماید. به عنوان مثال، نصف کردن قطر می‌تواند حساسیت را چهار برابر کند.

فاز پیوندی

آخرین ویژگی که باید در نظر بگیرید فاز پیوندی است. فاز پیوندی زنجیرهای متصل شده به سطح سیلیس است. فازهای پیوندی متداول شامل C18، C8 و فنیل است. اما C18 چیست و فرق آن با دیگر فازهای پیوندی چیست؟

C18 چیست؟

C18، C8 و C4 فازهای آلکیل سیلان خطی هستند. C18 همان اکتادسیل سیلان است و حاوی 18 کربن متصل به سیلیس است. بنابراین تعداد کربن و زنجیره‌ی کربنی بیشتری نسبت به C8 (8 کربن) یا C4 (4 کربن) دارد.

C18 به دلیل داشتن کربن‌های بیشتر، اندازه‌ی سطح بیشتری دارد که فاز متحرک باید از آن عبور کند. این امر سبب افزایش زمان برهم‌کنش بین فاز پیوندی و ماده‌های شسته‌شده می‌شود. بنابراین نمونه با سرعت کمتری شسته می‌شود و سرعت جداسازی بیشتری دارد.

در مقابل C8 (که اکتادسیل نیز نامیده می‌شود) برای زمان مارندگاری کوتاه بهتر است و پیک‌های تیزتری را ایجاد می‌کند. این نوع ستون برای ترکیبات آلی کوچک بهتر است، در حالی که C18 برای اسیدهای چرب با زنجیره دراز و مولکول‌های پیچیده بهتر است.

برچسب‌ها: , , , , , , , ,

نظرتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

Fill out this field
Fill out this field
لطفاً یک نشانی ایمیل معتبر بنویسید.

فهرست